石斛具有有性生殖和營(yíng)養(yǎng)生殖 2種繁殖方式，然而受限于溫暖高濕等環(huán)境因素，自然繁殖率極低，加之人為過(guò)度采摘和生境破壞，野生石斛資源逐年減少且瀕臨滅絕;野生馴化是解決石斛野生資源匱乏的根本途徑。組織培養(yǎng)技術(shù)是保存種質(zhì)資源的重要技術(shù)，并已成為蘭花產(chǎn)業(yè)種苗生產(chǎn)的一種常規(guī)方法，因此通過(guò)組織培養(yǎng)快速繁育石斛種苗對(duì)其資源保護(hù)及可持續(xù)利用具有重要意義。但石斛組培苗抗性差，種植存活率較低，必須進(jìn)行馴化，否則會(huì)嚴(yán)重影響移栽成活率。除光照、溫度、濕度、通風(fēng)等環(huán)境因子影響其組培苗生長(zhǎng)外，栽培基質(zhì)對(duì)石斛馴化起著重要作用，其直接影響到石斛的生長(zhǎng)發(fā)育和光合作用。國(guó)外采用松樹(shù)皮做基質(zhì)已有50多年的歷史，使用松樹(shù)皮做基質(zhì)石斛生物量顯著增加，長(zhǎng)勢(shì)較好。國(guó)內(nèi)僅對(duì)鐵皮(Dendrobium officinale Kimura et Migo)、金釵(Dendrobium nobile Lindl)、霍山(Dendrobium huoshanense)和鼓槌(Dendrobium chrysotoxum Lindl)等少數(shù)知名石斛基質(zhì)方面進(jìn)行了研究。水苔做基質(zhì)有利于提高石斛移栽初期存活率[4];水苔與樹(shù)皮結(jié)合可作為石斛的煉苗基質(zhì)，使用苔蘚或木屑作基質(zhì)也有同樣的效果，并且基質(zhì)的不同成分及配比對(duì)鐵皮石斛的存活率和生長(zhǎng)量影響顯著。組培苗基質(zhì)配制及處理不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致種苗存活率低，其中基質(zhì)的理化性質(zhì)起決定性作用，基質(zhì)通過(guò)影響根系氣、水的交換，進(jìn)而影響石斛莖葉的生長(zhǎng)，因此，栽培基質(zhì)要保證具有良好的保水性和通風(fēng)透氣性。

　　華石斛(Dendrobium sinense)是海南特有蘭科植物，自然分布于海南島中西部海拔1000 m以上的高山云霧林或山地雨林中;同時(shí)也是一種傳統(tǒng)的黎藥，因全草富含芪類(lèi)、聯(lián)芐類(lèi)等多類(lèi)化合物，具有良好的抗菌、抗腫瘤活性。華石斛在自然條件下結(jié)實(shí)率低，種子萌發(fā)成苗極為困難，華石斛野生種群數(shù)量不斷減少，目前已處于瀕危狀態(tài)。基質(zhì)對(duì)石斛移栽成活和生長(zhǎng)影響顯著，已研究結(jié)果表明，水苔保水和透氣性均較好，而水苔和樹(shù)皮結(jié)合又可促進(jìn)石斛生長(zhǎng)健壯、葉色濃綠，有利于組培苗存活和萌發(fā)新根、新芽。但基質(zhì)用量、緊實(shí)度等影響基質(zhì)保水及通氣性的指標(biāo)，造成水苔基質(zhì)過(guò)濕和樹(shù)皮基質(zhì)保水不夠等現(xiàn)象，在生產(chǎn)上十分常見(jiàn)。基質(zhì)透氣性和保水性矛盾，這可能與用量或基質(zhì)搭配有關(guān)。本研究設(shè)計(jì)4種基質(zhì)處理，通過(guò)對(duì)各基質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析及其對(duì)華石斛組培苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響，以期篩選出適宜華石斛組培苗的煉苗基質(zhì)。擬解決如下問(wèn)題：(1)探索基質(zhì)配比與華石斛組培苗煉苗成活率的關(guān)系;(2)研究基質(zhì)配比對(duì)華石斛組培苗煉苗期生長(zhǎng)情況的影響;(3)華石斛組培苗煉苗期基質(zhì)的優(yōu)化篩選。研究結(jié)果為華石斛組培苗對(duì)不同基質(zhì)的適應(yīng)性研究提供參考，為華石斛的規(guī)模化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 植物材料 華石斛組培苗：選取4片葉(葉色正常)、2～3條根(根長(zhǎng)2～3 cm)、無(wú)污染的健康苗。

　　1.1.2 試驗(yàn)區(qū)概況 本研究于2017年2—12月在海南省霸王嶺自然保護(hù)區(qū)(北緯 19°5′57″，東經(jīng)109°10′32″;海拔978 m)的塑料大棚內(nèi)進(jìn)行。山泉水pH 6.0，采用溫濕度自動(dòng)記錄儀LWS-Ⅱ測(cè)得環(huán)境因子如下：溫度18.3～35.0 ℃(平均23.4 ℃)，濕度52.4%～100%(平均94.9%，夜間100%)，光照度 0～18.4 klx(白天平均 3.4 klx)，風(fēng)速 0～3.7 m/s。

　　1.2 方法

　　1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究設(shè)計(jì)4種基質(zhì)處理進(jìn)行煉苗試驗(yàn)(表1)，所有基質(zhì)在種植前進(jìn)行殺菌處理。

　　表1 華石斛組培苗的基質(zhì)處理

　　Tab. 1 Substrate treatment for D. sinense tissue culture

　　1.2.2 試驗(yàn)處理 首先，把種植好的組培苗放置于75%的遮陽(yáng)網(wǎng)下7 d，組培苗不噴水(溫度持續(xù)較高時(shí)進(jìn)行少量葉面噴霧)，刺激其生根，初步適應(yīng)外界環(huán)境。1周后，以噴霧形式對(duì)組培苗補(bǔ)充少量水分，逐漸增加基質(zhì)含水量，使組培苗逐步適應(yīng)大棚環(huán)境，每隔7 d對(duì)葉面噴施稀釋3000倍的花多多高磷肥(N∶P∶K=9∶45∶15)，增加組培苗抗性，促進(jìn)石斛生根與萌芽。種植1個(gè)月后，每隔7 d噴施稀釋3000倍的高氮肥(N∶P∶K=30∶10∶10)，促進(jìn)石斛進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。7～10 d噴1次殺菌劑，多種殺菌劑交替使用，并進(jìn)行石斛常見(jiàn)病蟲(chóng)害防治和及時(shí)清理病株。每個(gè)處理設(shè)置3盤(pán)苗，每盤(pán)30叢，采用隨機(jī)區(qū)組排列。

　　1.2.3 指標(biāo)的測(cè)定 (1)基質(zhì)理化性質(zhì)的測(cè)定：采用飽和重力排水法測(cè)定基質(zhì)的孔隙度和氣水比;使用pH計(jì)測(cè)定基質(zhì)的pH。

　　(2)華石斛苗生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定：每隔1周統(tǒng)計(jì)組培苗的存活率和新芽率，存活率=存活叢數(shù)/總叢數(shù)×100%，新芽率=新芽叢數(shù)/總叢數(shù)×100%;每個(gè)處理隨機(jī)取5叢，使用游標(biāo)卡尺測(cè)定組培苗莖長(zhǎng)和莖粗;處理2個(gè)月后，華石斛苗的生長(zhǎng)基本穩(wěn)定，每個(gè)處理隨機(jī)取3叢測(cè)定壯苗指標(biāo)，采用烘干至恒重法測(cè)其地上部和地下部干重，計(jì)算地上部莖葉含水量和壯苗指數(shù)，壯苗指數(shù)=(莖粗/莖長(zhǎng)+地下部干重/地上部干重)×全株干重;5個(gè)月后各處理的植株葉片差異顯著，測(cè)其功能葉的葉長(zhǎng)、葉寬和葉面積。

　　(3)華石斛苗光合指標(biāo)的測(cè)定：處理2個(gè)月后，選取華石斛組培苗的功能葉，用SPAD-502Plus測(cè)定葉綠素相對(duì)含量，5次重復(fù)，取其平均值;在晴朗天氣的上午9：00—11：30使用Yaxin-1101光合測(cè)定儀測(cè)定凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度，每個(gè)指標(biāo)做3個(gè)重復(fù)，取其平均值。

　　1.3 數(shù)據(jù)處理

　　采用 SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)和Duncan多重比較，并對(duì)基質(zhì)的孔隙度與華石斛苗的生長(zhǎng)指標(biāo)作相關(guān)性分析。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 不同基質(zhì)的孔隙度及其對(duì)華石斛組培苗存活率的影響

　　不同基質(zhì)處理的理化性質(zhì)有所差異，JZ1和JZ3的容重、總孔隙度和氣水比相對(duì)較大，且JZ3顯著高于其他處理(表2)。JZ1與CK相比，加入樹(shù)皮后容重、孔隙度和氣水比均高于CK處理;CK和JZ2的pH顯著高于JZ1和JZ3，但均呈弱酸性，適宜華石斛生長(zhǎng)。種植2個(gè)月后，華石斛苗生長(zhǎng)情況基本穩(wěn)定，JZ3存活率最高，達(dá)56.3%，CK、JZ1、JZ2分別為21.0%、26.7%和20.3%，存活率較低;JZ3的新芽率顯著高于其他3種基質(zhì)，達(dá)39.0%。并且基質(zhì)的總孔隙度(0.98**)、持水孔隙度(0.98**)、通氣孔隙度(0.98**)和氣水比(0.90**)均與存活率呈極顯著相關(guān)關(guān)系。

　　表2 基質(zhì)的孔隙度與組培苗存活率的相關(guān)性分析

　　注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著。

　　2.2 不同基質(zhì)對(duì)華石斛苗形態(tài)指標(biāo)的影響

　　不同基質(zhì)處理對(duì)華石斛組培苗生長(zhǎng)指標(biāo)有較大差異(圖1)。2個(gè)月后，JZ2和JZ3的莖長(zhǎng)增長(zhǎng)量和鮮重增長(zhǎng)量顯著高于CK和JZ1，其中JZ3的處理最高;CK的莖粗相對(duì)增長(zhǎng)量顯著低于其他3個(gè)處理。生長(zhǎng) 5個(gè)月后，各基質(zhì)處理華石斛苗葉片變化較為明顯，CK和JZ1葉片呈細(xì)長(zhǎng)狀;JZ2和JZ3葉片較寬，生長(zhǎng)良好，葉面積增長(zhǎng)量顯著高于CK和JZ1處理(圖2);其中JZ3葉面積增長(zhǎng)量為最高，達(dá)到63.2%。

　　2.3 不同基質(zhì)處理對(duì)華石斛組培苗壯苗指數(shù)的影響

　　不同基質(zhì)處理對(duì)華石斛組培苗壯苗程度的影響有所差異(表3)。除莖粗外，JZ1與CK相比各指標(biāo)差異均不顯著，JZ3的莖長(zhǎng)顯著高于其他3個(gè)處理;JZ1、JZ2、JZ3的莖粗顯著高于CK;從地上部干重、地下部干重和壯苗指數(shù)來(lái)看，JZ2和JZ3顯著高于CK和JZ1，壯苗指數(shù)達(dá)0.015和0.016，并且基質(zhì)的總孔隙度(0.65*)、持水孔隙度(0.66*)、通氣孔隙度(0.64*)均與壯苗指數(shù)呈顯著相關(guān)關(guān)系，壯苗指數(shù)與氣水比(0.5)呈正相關(guān)。表明組培苗生長(zhǎng)需要一定的空間，并且基質(zhì)太少、失水過(guò)快不能起到保濕效果，不利于組培苗生長(zhǎng)。

　　2.4 不同基質(zhì)處理下華石斛組培苗的光合生理

　　圖1 不同基質(zhì)處理華石斛組培苗2個(gè)月的生長(zhǎng)量變化

　　不同的基質(zhì)處理對(duì)華石斛組培苗的光合指標(biāo)的影響有較大差異(表4)。各處理的氣孔導(dǎo)度無(wú)顯著差異;JZ2和 JZ3的胞間 CO2濃度顯著高于CK和JZ1;JZ3的蒸騰速率顯著高于CK和JZ1;JZ1和JZ3的葉綠素相對(duì)含量顯著高于CK和JZ2，達(dá)32.3和34.1，其中CK為最低;JZ3的凈光合速率顯著高于其他 3個(gè)處理，達(dá)到 7.806 μmol/(m2·s)。

　　圖2 華石斛小苗5個(gè)月的生長(zhǎng)變化量

　　表3 不同基質(zhì)下華石斛組培苗的壯苗指標(biāo)

　　注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著。

　　表4 不同基質(zhì)下華石斛組培苗的光合生理指標(biāo)

　　注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著。

　　3 討論

　　3.1 基質(zhì)特性對(duì)華石斛組培苗的影響

　　長(zhǎng)期以來(lái)，移栽成活率低一直是困擾石斛規(guī)模化生產(chǎn)的“瓶頸”。栽培基質(zhì)是基礎(chǔ)，種苗質(zhì)量是關(guān)鍵，基質(zhì)是石斛組培苗煉苗初期存活的重要因子，采用疏水透氣保水的栽培基質(zhì)可提高霍山、鼓槌等石斛的種植成活率，基質(zhì)的選擇是無(wú)土栽培成敗的關(guān)鍵。石斛長(zhǎng)新根和新芽需要基質(zhì)保水能力好，根數(shù)和新芽的生長(zhǎng)量主要依靠基質(zhì)中的水分和養(yǎng)分，幫助石斛快速恢復(fù)生長(zhǎng)。華石斛氣生根、附生和喜溫暖高濕的特性使其對(duì)基質(zhì)透氣性、保水和疏水性要求較高。樹(shù)皮能顯著提高鐵皮石斛的鮮質(zhì)量和株高等生長(zhǎng)指標(biāo)，水苔可顯著提高鐵皮石斛光合色素的合成，從而提高葉片的光合作用。本研究結(jié)果顯示，用水苔作為基質(zhì)有利于華石斛組培苗生根、長(zhǎng)新芽，可作為組培苗生長(zhǎng)所需基質(zhì)，其中用水苔在5 cm透明塑料杯種植為最佳種植方式。但水苔的處理不同，其透氣性和保水性有所差異，如水苔中加入少量樹(shù)皮，可達(dá)到增加孔隙度和透氣的作用，從而通過(guò)影響根系的水分吸收和透氣性影響石斛存活率;用105孔穴盤(pán)種植，水苔用量較少，且過(guò)于緊實(shí)，保水和透氣性低于5 cm透明塑料杯。水苔在透氣、透水方面存在明顯不足，而且容易爛根和蟲(chóng)害入侵，這可能是限制華石斛組培苗成活率的主要原因，因此華石斛煉苗基質(zhì)在既保水又透氣方面還有待進(jìn)一步改善。

　　3.2 基質(zhì)配比對(duì)華石斛組培苗形態(tài)指標(biāo)的影響

　　基質(zhì)為石斛提供水分、養(yǎng)分和保證根系氣體交換，進(jìn)而影響鐵皮石斛的生物量。華石斛在2個(gè)月內(nèi)葉片無(wú)明顯變化，但莖長(zhǎng)、莖粗和鮮重增長(zhǎng)量較為明顯，并且各處理間差異顯著。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)通透性高，則莖粗增加量較大;基質(zhì)用量較大保水性較好，莖長(zhǎng)和鮮重顯著增加。水分脅迫會(huì)導(dǎo)致鐵皮石斛葉片光反應(yīng)能力降低，抑制葉綠素的合成。5個(gè)月后葉片差異顯著，CK和JZ1處理差異不顯著，葉片均呈細(xì)長(zhǎng)狀，葉寬和葉長(zhǎng)增長(zhǎng)量均顯著小于JZ3處理，說(shuō)明CK和JZ1保水性和透氣性稍差于JZ3，根部吸收水分不穩(wěn)定、根系透氣性差，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)不良，葉面積增加量相對(duì)較少。葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，葉綠素含量是反映植物光合能力和健康狀態(tài)的重要指標(biāo)[23]，水分脅迫直接導(dǎo)致碧玉蘭葉片的葉綠素含量降低，葉面積較小和葉片的非正常生長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致植株葉綠素含量和凈光合速率較低。JZ2的葉寬增長(zhǎng)量明顯高于葉長(zhǎng)，且基質(zhì)透氣性高于CK，但其保水性與CK無(wú)明顯差異;JZ3與CK相比，增加了水苔的用量，葉長(zhǎng)和葉寬同步增加，生長(zhǎng)正常;JZ2與 JZ3相比水苔用量較少，說(shuō)明JZ2用量較少，基質(zhì)保水性方面稍弱于 JZ3，因此 JZ2可在保證透氣性的基礎(chǔ)上增加水苔用量，保證石斛的正常生長(zhǎng)。

　　3.3 基質(zhì)配比對(duì)華石斛組培苗物質(zhì)累積和壯苗指標(biāo)的影響

　　植株的生物量不僅反映了植株對(duì)水分、營(yíng)養(yǎng)的吸收能力，還反映了植株的健康水平。石斛光合作用碳同化具備兼性 CAM植物的特征，大都生長(zhǎng)緩慢，低光合作用能力是石斛生長(zhǎng)緩慢的重要原因。光合作用直接反映作物的生長(zhǎng)狀況，其很大程度上影響金釵石斛的生長(zhǎng)速度，根系的水、氣交換不良，植株生長(zhǎng)不良，導(dǎo)致光合速率的降低;凈光合速率代表植物物質(zhì)累積的能力，凈光合速率降低導(dǎo)致植株物質(zhì)積累較少，壯苗指數(shù)較低。本研究結(jié)果表明，不同的基質(zhì)處理對(duì)華石斛組培苗生長(zhǎng)狀態(tài)有明顯差異。2個(gè)月后CK和JZ1的莖長(zhǎng)和莖粗增加不明顯，遠(yuǎn)低于JZ2和JZ3，進(jìn)而導(dǎo)致鮮重降低;JZ3的葉片深綠肥厚，表現(xiàn)為較強(qiáng)的光合作用能力，鮮重和壯苗指數(shù)較大。

　　綜上所述，在華石斛組培苗煉苗期間，以5 cm透明塑料杯裝16.3 g水苔作基質(zhì)進(jìn)行種植，華石斛組培苗存活率較高，生長(zhǎng)指標(biāo)和光合指標(biāo)反應(yīng)較好，可作為華石斛大棚煉苗的優(yōu)良基質(zhì)。由于組培苗生長(zhǎng)緩慢、抗逆性差等原因，因此要提高組培苗存活率，必須提高組培苗的抗性。在如何提高華石斛組培苗的抗逆性、改善基質(zhì)保水透氣性等方面，仍需做進(jìn)一步的研究。